La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una metodologia innovativa adottata in medicina e nella biologia molecolare, finalizzata alla produzione di innumerevoli copie di una specifica sezione di DNA, tra cui singoli geni. Questo procedimento, noto come amplificazione, permette a scienziati e professionisti del settore di ottenere un campione di DNA sufficiente per l’analisi approfondita, partendo da una quantità inizialmente limitata.
Applicazioni della PCR
Le copie di DNA generate attraverso la PCR hanno una vasta gamma di applicazioni che vanno dalla ricerca di base alla diagnostica delle malattie, ai test di agricoltura e alle indagini forensi. Un esempio significativo è dato dal Progetto Genoma Umano, che ha utilizzato ampiamente la PCR nelle sue analisi di mappatura.
Questa tecnica è considerata tra i progressi più significativi in biologia molecolare, cambiando radicalmente il modo in cui viene studiato il DNA. Il suo inventore, Kary B. Mullis, insieme a Michael Smith, ha ricevuto nel 1993 il premio Nobel per la chimica per il suo contributo in questo campo.
Funzionamento della DNA polimerasi
La PCR riproduce in vitro un particolare passaggio della duplicazione cellulare che normalmente è svolto dalla DNA polimerasi, un enzima chiave per la sintesi del DNA presente in tutti gli organismi viventi. Questo enzima è fondamentale per replicare in modo preciso ed efficace il genoma, garantendo così la trasmissione corretta delle informazioni genetiche attraverso le generazioni. In particolare, la polimerasi catalizza la polimerizzazione dei 2′-desossiribonucleotidi lungo un filamento di DNA, utilizzando il filamento stesso come modello.
La reazione di polimerizzazione si attua attraverso l’incorporazione di 2′-desossinucleoside-5′-trifosfati, che si convertono in 2′-desossinucleoside-5′-monofosfati, con un rilascio di pirofosfato. L’inserimento di nucleotidi avviene seguendo il principio di complementarità, garantendo che il filamento appena sintetizzato sia identico a uno dei filamenti della doppia elica del DNA.
Ciclo della PCR
Il ciclo della PCR si articola in tre fasi. La prima, denominata denaturazione, vede il riscaldamento del DNA a doppio filamento a temperature di 94-95°C per un intervallo di 15-30 secondi. Questo processo provoca la rottura dei legami idrogeno tra le basi, separando così i due filamenti.
La fase di denaturazione porta quindi alla creazione di due filamenti singoli, che fungeranno da stampi per le nuove copie. È cruciale mantenere la temperatura per un tempo sufficiente a completare questa separazione. Successivamente, si passa alla fase di ricottura, in cui la temperatura è abbassata per facilitare il legame dei primer di DNA a punti specifici del filamento stampo. Questa fase dura normalmente tra 10 e 30 secondi e si svolge a temperature comprese tra 50 e 65°C.
In questa fase, i primer servono come punto di partenza per la sintesi del DNA, creando una breve regione di DNA a doppio filamento per l’enzima polimerasi. Una volta legato il primer, la polimerasi può agire per costruire il nuovo filamento complementare, il passo di estensione.
Infine, l’ultima fase, l’estensione, viene eseguita aumentando la temperatura a 72°C per permettere alla Taq DNA polimerasi di generare nuovo DNA. Questo enzima, estratto da batteri termofili come l’Thermus aquaticus, è in grado di rimanere attivo anche a temperature elevate, permettendo di realizzare la PCR senza dover aggiungere nuove polimerasi ad ogni ciclo.
Uso del termociclatore
Il processo di PCR viene ripetuto per un numero compreso tra 20 e 40 cicli, raddoppiando le copie di DNA ad ogni passaggio grazie a una progressione geometrica. Questo rende la tecnica particolarmente utile per molteplici applicazioni, come le analisi forensi o l’esame di campioni con poche cellule.
Un termociclatore, specificamente progettato per controllare il trasferimento di calore e mantenere temperature precise, esegue la reazione a catena della polimerasi. Questo dispositivo può essere programmato su misura per ogni fase del protocollo PCR e consente di memorizzare più protocolli per impieghi futuri.
Caratteristiche cruciali di un termociclatore standard includono un blocco campione in metallo termoconduttore, moduli termoelettrici per un rapido riscaldamento e raffreddamento, e un coperchio riscaldato per prevenire l’evaporazione dei campioni. Grazie all’uso di moduli termoelettrici, il termociclatore riesce a combinare i requisiti di riscaldamento e refrigerazione, completando la PCR in tempi che variano da meno di un’ora a diverse ore a seconda della velocità della macchina.
