Elettroforesi su gel: alla scoperta dei segreti della vita

L’elettroforesi su gel è una tecnica fondamentale nella biologia molecolare e nella genetica, ed è utilizzata in una vasta gamma di applicazioni di ricerca e diagnostica. Il processo coinvolge l’uso di un gel, solitamente di agarosio o poliacrilammide, che funge da matrice per separare i diversi frammenti di acidi nucleici in base alle loro dimensioni, alle loro cariche e alla loro conformazione. Queste matrici fungono da mezzi porosi e si comportano come un setaccio molecolare.

L’elettroforesi su gel fu usata per la prima volta nel 1931 dal biochimico svedese Arne Wilhelm Kaurin Tiselius premio Nobel per la chimica nel 1948.

La maggior parte delle molecole biologiche trasporta una carica netta a qualsiasi pH diverso dal loro punto isoelettrico e migrerà a una velocità proporzionale alla loro densità di carica. La mobilità di una molecola attraverso un campo elettrico dipende da diversi fattori.

Tra essi l’intensità del campo, carica netta, dimensione e forma della molecola, forza ionica e proprietà della matrice attraverso la quale la molecola migra come, ad esempio, la viscosità e la dimensione dei pori.

L’agarosio ha una grande dimensione dei pori ed è adatto per separare acidi nucleici e grandi complessi proteici. La poliacrilammide ha una dimensione dei pori più piccola ed è ideale per separare la maggior parte delle proteine ​​e gli acidi nucleici più piccoli.

In generale, a prescindere dalla matrice, l’elettroforesi su gel è una tecnica che separa le macromolecole come le proteine ​​in base alla loro mobilità elettroforetica, cioè la capacità degli analiti di muoversi verso un elettrodo di carica opposta

SDS-PAGE e elettroforesi su gel

A differenza del DNA e dell’RNA, le proteine ​​variano a seconda degli amminoacidi. Le proteine, infatti, hanno una struttura secondaria determinata dalla disposizione nello spazio degli atomi dello scheletro proteico caratterizzata da legami a idrogeno tra i gruppi ammidici ed i gruppi carbonilici dello scheletro polipeptidico.

La struttura secondaria influisce su come le proteine possono muoversi attraversi i pori della matrice. Pertanto, a volte può essere necessario, se è richiesta una stima accurata delle dimensioni denaturare le proteine ​​prima dell’elettroforesi per renderle lineari.

Si parla quindi di L’SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, ossia elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato. Quest’ultimo noto anche come laurilsolfato di sodio rompe i legami non covalenti ed in particolare i legami a idrogeno nelle proteine denaturandole facendo perdere loro la conformazione nativa.

Il sodio dodecil solfato agisce a caldo e in presenza di un riducente come il 2-mercaptoetanolo che scinde i ponti disolfuro. La componente anionica dell’SDS lega la catena peptidica conferendo una carica negativa alla proteina proporzionale alla sua massa.

Questa tecnica è dovuta al biochimico e biologo svizzero Ulrich Karl Laemmli professore di biologia molecolare presso l’università di Ginevra ed è tipicamente utilizzata per separare proteine ​​da 5 a 250 kDa.

Funzionamento dell’elettroforesi su gel

Il dispositivo è un vassoio su cui si trova una lastra di gel di poliacrilammide o di agarosio immersa in una soluzione tampone che serve a mantenere stabile il pH a cui si vuole operare. Ad un’estremità vi sono una serie di pozzetti dove possono essere caricati diversi campioni.

Questo apparecchio è inoltre dotato di elettrodi a ciascuna estremità, con il catodo, o elettrodo caricato negativamente, all’estremità dove si trovano i pozzetti, e l’anodo, o elettrodo caricato positivamente, all’altra estremità.

Una volta collegato a un erogatore di corrente elettrica le biomolecole si muovono attraverso il gel in base alla loro carica e dimensione. I frammenti più piccoli hanno spesso un basso peso molecolare viaggiano rapidamente attraverso il gel, coprendo una distanza maggiore. Al contrario, i frammenti più grandi hanno un peso molecolare più elevato si muovono lentamente attraverso il gel.

Una volta completata la separazione, la corrente viene disattivata e al sistema viene aggiunto un colorante legante la molecola di interesse che emette una luce fluorescente alla luce U.V.

I  dati si presenteranno come bande sottili che a volte assomigliano a una scala e ciascuna di esse contiene migliaia di molecole identiche di quella particolare lunghezza. Oltre a separare miscele di DNA o RNA in base alla lunghezza, identificare varianti genetiche, confermare la presenza di determinate sequenze di DNA o RNA, studiare la struttura di geni specifici questa tecnica può essere utilizzata anche per separare miscele di proteine ​​in base alla carica elettrica offrendo informazioni sull’identità delle catene laterali o una serie di altre applicazioni molto utili.

La semplicità e l’immensa utilità dell’elettroforesi su gel ne fanno oggi una parte molto importante di qualsiasi laboratorio di biologia molecolare.