Legge di Lambert-Beer: deviazioni positive e negative

La legge fondamentale dell’analisi in assorbimento, nota come legge di Lambert-Beer stabilisce una relazione tra l’estinzione e la concentrazione della sostanza disciolta ed è alla base dell’analisi chimica quantitativa.

Quando una radiazione luminosa incide su un mezzo trasparente, in parte è riflessa, in parte si rifrange nel mezzo. L’intensità di questa frazione diminuisce man mano che la radiazione si propaga, per cui all’uscita risulterà inferiore.

Nella figura:

I_o è l’intensità della luce incidente mentre I è l’intensità della luce che fuoriesce. Il rapporto I/I_o è definito come trasmittanza complessiva del mezzo .

Il logaritmo decimale del reciproco della trasmittanza prende il nome di estinzione o assorbanza:
A = log 1/T = log I_o/I

La legge di Lambert-Beer  stabilisce una proporzionalità diretta tra l’assorbanza e la concentrazione della specie assorbente:
A = log I_o/I = abc

Dove a è una costante di proporzionalità, chiamata assorbanza specifica, b è lo spessore della soluzione attraversato dalla radiazione espresso in centimetri, c la concentrazione della sostanza assorbente nella soluzione. Se quest’ultima è espressa in mol/L , l’assorbanza specifica prende il nome di coefficiente di estinzione molare, ε e, di conseguenza, A = εbc.

Per la proporzionalità diretta tra l’assorbanza e la concentrazione della specie assorbente riportando in grafico l’assorbanza in funzione della concentrazione si ottiene una retta passante per l’origine.

Deviazioni positive o negative dalla legge di Lambert-Beer

Tuttavia la legge non è valida in tutte le condizioni infatti si può avere una deviazione positiva o negativa come rappresentato in figura:

Fattori che determinano deviazioni 

1)      Presenza di elettroliti

Ad alte concentrazioni le molecole di soluto possono dare una diversa distribuzione della carica delle specie circostanti e, poiché l’assorbimento coinvolge un fenomeno elettronico, le alte concentrazioni possono dare uno shift della lunghezza d’onda assorbita dall’analita.

Si tenga comunque presente che la legge di Lambert-Beer è valida per soluzioni diluite con concentrazioni inferiori a 10 mM infatti se la concentrazione è maggiore l’analita si comporta in modo diverso a causa delle interazione con il solvente e con le altre molecole di soluto.

2)      pH

Vi sono molte sostanze il cui stato ionico è influenzato dalla presenza di ioni H⁺: un tipico esempio è dato dagli indicatori acido-base che sono acidi o basi deboli la cui dissociazione è data dall’equilibrio:

HIn + H₂O ⇄ In^– + H₃O⁺

L’acido e la base coniugata sono in equilibrio e hanno lo stesso valore di assorbanza a una certa lunghezza d’onda. Ad esempio per il blu bromotimolo si osserva che alla lunghezza d’onda 501 nm tutte le specie hanno la stessa assorbanza: tale lunghezza d’onda è detta punto isosbestico in cui  il valore dell’assorbanza non dipende dal valore della concentrazione delle singole specie, ma dalla somma di queste.

Essendo questo un caso di cromofori interconvertibili, lo spettro mostra il un punto isosbestico, cioè una lunghezza d’onda in cui l’assorbanza è indipendente dal pH.

In figura viene riportata l’assorbanza in funzione della lunghezza d’onda del blu bromotimolo a diversi valori di pH

3)      Complessazione, associazione o dissociazione

Alcuni sali hanno la tendenza a formare complessi i cui colori sono diversi da quelli dei singoli composti. Il grado di formazione del complesso aumenta con l’aumentare della concentrazione quindi la legge di Lambert-Beer non può essere applicata per alte concentrazioni. Analoghe deviazioni si verificano quando l’analita si dissocia o si associa in soluzione in quanto la natura delle specie presenti in soluzione dipende dalla concentrazione.

Inoltre deviazioni dalla legge di Lambert-Beer possono verificarsi in presenza di radiazione non-monocromatica e nel caso la temperatura non venga mantenuta costante.