Come determinare gli amminoacidi in una proteina
Per identificare la sequenza degli amminoacidi in una proteina, è necessario condurre un’analisi qualitativa e quantitativa degli amminoacidi presenti. Questo processo avviene in due fasi:
1) Idrolisi di una quantità nota di proteina
2) Separazione degli amminoacidi
Idrolisi
L’idrolisi avviene mediante il riscaldamento della proteina a 100-100 gradi centigradi in HCl 6 N per circa 24 ore. Le proteine con molti gruppi idrofobi ingombranti possono richiedere un tempo maggiore. È importante considerare che il triptofano è sensibile agli acidi e può essere parzialmente distrutto durante l’idrolisi. Inoltre, se vi sono glutammina e asparagina, si ottengono ammoniaca, acido glutammico e acido aspartico come prodotti.
Separazione
La miscela di amminoacidi ottenuta dall’idrolisi può essere separata e analizzata utilizzando tecniche cromatografiche. Le colonne separate costituite da resine a scambio ionico vengono utilizzate per separare gli amminoacidi a pH specifici. La ninidrina, un reagente altamente specifico, viene utilizzata per rilevare la presenza degli amminoacidi.
Analisi spettrofotometrica
Un’apparecchiatura spettrofotometrica viene impiegata per misurare l’assorbimento ottico dei prodotti di reazione con la ninidrina, mentre un registratore riporta i millilitri di eluato contro l’intensità del colore della ninidrina. La posizione del picco di assorbimento, che dipende dal volume di soluzione tampone necessario per eluire un determinato amminoacido, è caratteristica per ciascun amminoacido, consentendo quindi un’analisi qualitativa. Inoltre, la concentrazione di ciascun amminoacido è proporzionale all’assorbanza della soluzione e le rispettive quantità possono essere calcolate misurando l’area sottostante il picco, permettendo un’analisi quantitativa.
In conclusione, la determinazione dei singoli amminoacidi in una proteina richiede una serie di passaggi accurati e sofisticati, che consentono di identificarli e analizzarli in modo qualitativo e quantitativo.